Молекулярно-генетическое исследование ПЦР является золотым стандартом, который рекомендован для диагностики COVID-19. Однако далеко не все люди даже с медицинским образованием имеют верное представление о том, что происходит за дверями ПЦР-лаборатории. Чтобы этот пробел восполнить, следует обратить внимание на несколько важных моментов, которые нужно знать о диагностике коронавирусной инфекции методом ПЦР.
Исследование начинается задолго до того, как материал попадает в лабораторию.
Большинство людей об этом никогда не задумываются, но такие этапы, как забор биологического материала, его хранение и транспортировка, являются очень важными и самыми уязвимыми в плане возможных ошибок.
Любое лабораторное исследование можно разделить на четыре этапа: преаналитический этап вне лаборатории, преаналитический этап в лаборатории, аналитический и постаналитический. Преаналитическая стадия занимает до 60 % времени, которое уходит на лабораторные исследования, причем около 20 % времени проведения лабораторного исследования тратится на подготовительные процессы вне стен лаборатории.
Важно, чтобы и медицинские сестры, и фельдшеры-лаборанты, и врачи, и даже водители-курьеры понимали: успешная диагностика во многом зависит от их работы. Ошибки, возникающие на преаналитическом этапе, обесценивают дальнейший ход лабораторных исследований, приводят к потере значительных средств, дискредитируют лабораторные методы в глазах лечащего врача из-за недостоверности получаемых результатов.
Важно, чтобы биоматериал для исследования был взят правильно, в срок и с учетом места максимальной локализации возбудителя.
Для диагностики COVID-19 чаще всего используется мазок со слизистой оболочки носоглотки и задней стенки ротоглотки при обследовании лиц, находящихся под медицинским наблюдением как контакты первого уровня или при вероятном случае COVID-19. К вероятному относится случай острой респираторной инфекции, сопровождающийся лихорадкой, кашлем, клиническими, рентгенологическими или морфологическими признаками паренхиматозного поражения легких, у лица со следующими эпидемиологическими критериями в анамнезе: контакт в течение последних 14 дней до появления симптомов заболевания с лицом, у которого выявлен вероятный или подтвержденный случай инфекции COVID-19; пребывание в течение последних 14 дней до появления симптомов заболевания за пределами Республики Беларусь.
Максимальная концентрация вирусов в этих отделах достигается на 2–3-й день с момента появления симптомов болезни. Поэтому материал для ПЦР-исследования предпочтительнее брать в указанные сроки. Однако клиницистам не стоит забывать, что у пациентов с признаками заболевания можно взять для исследования не только мазки из ротоглотки и носоглотки, но и аспират из трахеи, бронхоальвеолярный лаваж или мокроту (при наличии) — это может исключить ложноотрицательный результат исследования. В практике бывали случаи, когда у одного и того же пациента вирус обнаруживался в бронхоальвеолярном лаваже, но не обнаруживался в мазке.
Важно и то, что биологический материал для исследования должен быть взят в достаточном объеме и в условиях, исключающих контаминацию. После взятия образцы необходимо своевременно доставить в лабораторию.
Каждая буква в документах, сопровождающих пробы, имеет значение.
Первое, что происходит в лаборатории после доставки проб, — это их прием и регистрация — проверка сохранности проб и принятие решения о приеме или отклонении.
В момент приема проб определяется, какие анализы будут проведены, проба заносится в лабораторный журнал регистрации. Зарегистрированную пробу маркируют. Лабораторный или рабочий номер, присвоенный образцу, уникален, что позволяет отслеживать конкретный образец. На этом этапе очень важно, чтобы привезенные в лабораторию пробы были подписаны верно, а сопровождающие их направления — заполнены правильно и четко, ведь даже одна неверная буква в фамилии пациента может сделать его результат «пропавшим без вести».
Не стоит рассчитывать на быстрый результат, если образцы доставляются единовременно в конце дня.
После того как пробы зарегистрированы, начинается этап пробоподготовки, или преаналитический лабораторный этап. Во многих источниках, описывающих диагностику коронавирусной инфекции, можно найти фразу вроде «Время проведения исследования занимает 5–7 часов». Такая информация указана, в частности, в инструкции к тест-системам для диагностики. Здесь следует понимать, что это верно для одной пробы начиная с этапа пробоподготовки. На деле же до того, как образец биологического материала попадет в руки фельдшеру-лаборанту или врачу ПЦР-лаборатории, в самом лучшем случае пройдет пять часов — это и есть преаналитический этап вне лаборатории: забор материала, оформление направлений, транспортировка в лабораторию плюс время на прием и регистрацию образцов. Поэтому важна обратная связь с учреждениями, доставляющими материал на исследование.
Идеально, если доставка распределяется равномерно в течение дня. Тогда на лабораторию не падает повышенная нагрузка, как в случае, если большую часть образцов нужно принять в конце дня. Равномерность позволяет также сократить сроки выдачи ответов: то, что привезли утром, будет сделано к вечеру.
На постановку 96 образцов у опытного сотрудника уходит 5–6 часов.
ПЦР-исследование разделено на несколько этапов, кратко их можно описать как пре-ПЦР, или экстракция нуклеиновых кислот, и непосредственно ПЦР-реакция, или амплификация. Длительность этих этапов зависит от наборов реагентов, с которыми работает лаборатория, и от количества образцов, единовременно взятых в работу, — чаще всего это 24, 48 или 96 образцов (числа кратны двенадцати, так как это удобно при работе с лабораторным оборудованием — центрифугами, штативами и т. д.).
Даже не углубляясь в тонкости ПЦР-анализа, нетрудно догадаться, что работать с 24 или тем более с 96 пробами одновременно гораздо дольше, чем с одной пробой. На постановку 96 образцов опытный сотрудник тратит в среднем 5–6 часов, без учета интерпретации результатов и времени на выдачу ответов.
Мощность лаборатории определяется техническим оснащением, количеством персонала и графиком работы. В среднем ПЦР-лаборатории Минска, задействованные в диагностике COVID-19, выполняют 300–700 исследований в сутки, в зависимости от загруженности.
Результаты исследования зависят от чувствительности и специфичности наборов реагентов.
После интерпретации результатов ПЦР-исследования врачом лабораторной диагностики выдается заключение. При исследовании на COVID-19 заключение может быть трех видов: «РНК SARS-CoV-2 не обнаружена» (трактуется как отрицательный результат), «РНК SARS-CoV-2 обнаружена» (трактуется как положительный) или «Анализ повторить».
Результаты зависят от чувствительности и специфичности наборов реагентов, с помощью которых выполнялось исследование. Чувствительность — это степень, в которой не упускаются из виду истинные положительные результаты (чем выше чувствительность, тем меньше ложноотрицательных результатов), а специфичность — это степень, в которой истинные отрицательные результаты классифицируются как таковые (чем выше специфичность, тем меньше ложных положительных результатов).
Чувствительность обычно указывается производителями тест-систем и выражается в числе копий на миллилитр, то есть указывает то минимальное количество генетического материала, которое способна уловить данная тест-система. Чувствительность тест-систем разных производителей может иметь разбежку на несколько порядков, что может влиять на воспроизводимость результатов в лабораториях, которые используют различные наборы реагентов. Специфичность тест-систем для диагностики SARS-CoV-2 колеблется от 99 до 99,5 %.
Необходимость повторного анализа может возникнуть, и относиться к этому следует с пониманием.
Повторение анализа может потребоваться в нескольких случаях: результат анализа невалидный (не подлежит учету) или результат анализа сомнительный (обнаружена РНК SARS-CoV-2, но на границе чувствительности метода). Невалидный результат может быть следствием ошибок на преаналитическом этапе (неправильный забор материала, недостаточное количество клеток эпителия в мазке, неправильное хранение образца), а сомнительный результат чаще всего проявляется при незначительной концентрации вируса у пациента или при контаминации проб биологического материала на этапе забора или транспортировки.
В обоих случаях стоит с пониманием относиться к процедуре повторного анализа. В конце концов, и пациенты, и врачи-клиницисты, и лабораторная служба заинтересованы в том, чтобы получить точные и достоверные результаты.