Система геномного редактирования CRISPR/Cas9 на сегодняшний день является наиболее известным и доступным инструментом для выполнения целенаправленных модификаций генома. Ее появление — это новый виток в развитии биомедицинских исследований. Впервые у ученых появилась возможность с высокой точностью и относительной простотой редактировать геном практически любого организма.
Механизмы включения и выключения генов
В основе метода лежат механизмы, существующие у прокариот: бактерии и археи используют CRISPR-Cas-системы как аналог приобретенного иммунитета для защиты от чужеродного генетического материала, запоминая фрагменты чужой ДНК и разрушая ее при повторном заражении.
В ходе изучения возможностей системы CRISPR/Cas9 были проведены эксперименты по ее доставке в клетки млекопитающих. В исследованиях было установлено, что рибонуклеопротеидный комплекс Cas9 способен эффективно редактировать геном, инициируя двухцепочечный разрыв в строго определенном локусе (см. рисунок). Данное событие является мощным индуктором ответа репарационных систем клетки, которые способны «залатать» полученный разрыв.
Ключевые возможности применения технологии CRISPR/Cas9 в медицине заключаются в выключении (нокаут, knock-out) и включении (нокин, knock-in) генов, а также их изменении. Это так называемые молекулярные ножницы, способные с высокой точностью вырезать и заменять поврежденные участки ДНК.
Использование технологии …в генной терапии
Наследственные генетические заболевания вызваны изменениями (мутациями) в геномных последовательностях, где частой проблемой является образование функционально неактивной формы белка.
Использование CRISPR/Cas9 оказалось крайне удобным инструментом в исправлении данных дефектов и открыло путь к разработкам новых методов лечения ранее неизлечимых наследственных заболеваний. Важно понимать, что редактирование генов соматических клеток влечет за собой геномные изменения, которые не будут наследоваться, что делает метод использования безопасным в долгосрочной перспективе.
В 2021 году было проведено исследование использования CRISPR/Cas9 для редактирования гена α-глобина в гемопоэтических стволовых клетках при β-талассемии. Стратегия лечения состоит в реализации нокаута (выключении) гена α-глобина и вставки гена нормального β-глобина.
Таким образом, устранение дисбаланса α/β-глобина в талассемических гемопоэтических стволовых клетках путем снижения уровня α-глобина с экспрессией трансгена β-глобина ведет к излечению пациентов с β-талассемией.
В 2023 году были предприняты попытки использования системы геномного редактирования на клетках бронхиального эпителия человека при муковисцидозе. Доставка комплекса CRISPR/Cas9 с матрицей (полноценной копией гена, ответственного за данное заболевание) позволила добиться экспрессии функционально активной формы белка. Конечно, при проведении манипуляций с геномом всегда возникают сомнения относительно его безопасности. Однако риск хромосомных нарушений в данных экспериментах был минимальным и составлял <0,001 %.
С каждым годом список используемых системой CRISPR/Cas9 генов для редактирования растет. На мышиных моделях были получены многообещающие результаты для терапии гемохроматоза (редактирование адениновых оснований гена HFE), болезни Альцгеймера (снижение образования β-амилоидов в клетках с редактированным геном Bace1), гемофилии (редактирование гена F9 в плюрипотентных стволовых клетках, редактирование гена F8 в эндотелиальных клетках), анемии Фанкони, гиперхолестеринемии, фенилкетонурии, тирозинемии 1-го типа, катаракты, бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона, нейрофиброматоза, тяжелого комбинированного иммунодефицита и т. д.
В июне 2026 года были опубликованы результаты работы генетиков из Колумбийского университета. Ученые использовали модифицированную версию CRISPR/Cas9 для редактирования оснований и корректировки патогенных вариантов генов PCSK9 и HBG в эмбрионах человека. Данная работа вызвала бурные обсуждения относительно этической стороны исследования.
…в иммунотерапии онкозаболеваний
CAR-T-терапия представляет собой один из наиболее прогрессивных методов лечения злокачественных новообразований, основанный на применении генетически модифицированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы (CAR — Сhimeric Antigen Receptor). Эти рецепторы позволяют Т-клеткам специфически распознавать и уничтожать опухолевые клетки независимо от презентации антигена главным комплексом гистосовместимости (MHC).
Несмотря на впечатляющие результаты, данный подход имеет ряд существенных ограничений. Ключевыми недостатками являются индивидуализированный характер CAR-T-терапии, быстрое истощение, низкая устойчивость к ингибированию микроокружением опухоли и сниженная противоопухолевая активность.
Создание химерного антигенного рецептора стало прорывным событием в области онкологии, однако полный потенциал развития CAR-T еще не раскрыт. Проблема состоит в сложном устройстве сигнальных путей активации, ответа и общего метаболизма Т-лимфоцитов. Используемые аутологичные клетки часто имеют худшие фенотипические характеристики по сравнению с лимфоцитами здорового донора. Прохождение химиотерапии, лучевой терапии значительно отражается на пролиферативной активности и противоопухолевой эффективности CAR-T-клеточного продукта.
Логичной оптимизацией метода является создание протокола получения аллогенных CAR-T от здорового человека. Для решения данной задачи на базе РНПЦ ДОГИ была разработана стратегия создания аллогенных CAR-T-клеток путем мультиплексного нокаута генов B2M и TRAC/TRBC с использованием технологии CRISPR/Cas9.
Продукты этих генов являются константными доменами главного комплекса гистосовместимости I класса (MHCI) и Т-клеточного рецептора (TCR). Их присутствие на поверхности клеток донора выступает основной причиной развития отторжения чужеродных клеток. Мультиплексный нокаут данных генов в специфичных CAR-T-клетках повышает противоопухолевую активность и снижает аллореактивность используемых аллогенных CAR-T. При этом редактирование несет в себе в первую очередь цель модернизации, функционального улучшения и оптимизации CAR-T-клеток для раскрытия их полного потенциала.
CRISPR/Cas9-редактирование CAR-T продемонстрировало в экспериментальных моделях высокую эффективность в отношении мишеней, которые являлись «тормозным» механизмом для развития ответа на опухоль.
В настоящее время специалистами РНПЦ ДОГИ создана экспериментальная платформа аллогенных CAR-T клеток, которая проходит серию экспериментальных испытаний in vitro.
Преодоление непредсказуемых эффектов
Система CRISPR/Cas9 совершила революцию в генной инженерии, предложив исследователям простой, точный и гибкий инструмент для редактирования генома. Однако именно ее мощь и универсальность порождают главную проблему: за кажущейся легкостью внесения изменений в ДНК скрывается глубокая сложность последствий, которые до сих пор не изучены. Гибкость CRISPR позволяет адаптировать ее под любые организмы и ткани, что упрощает фундаментальные исследования в области генетики, эпигенетики и регенеративной медицины. Главная задача исследователей — преодоление непредсказуемости и индивидуальности последствий редактирования.
CRISPR/Cas9 вызывает не только целевые изменения (в заданном локусе), но и может спровоцировать непреднамеренные мутации, включая хромосомные перестройки, а также эффекты off-target — изменения в гомологичных или даже отдаленных участках генома. Характер и частота этих нежелательных событий варьируют от клетки к клетке, от ткани к ткани, от организма к организму и зависят от конкретной последовательности видовой РНК (sgRNA), типа доставки, времени экспрессии Cas9 и многих других факторов.
Исследователи сегодня стоят перед двойной задачей: расширять применение системы и одновременно жестко контролировать безопасность на этапах от подбора видовой РНК до геномного анализа последствий. Только такой подход позволит превратить CRISPR из инструмента с непредсказуемым исходом в надежную технологию будущего.