В РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии всегда уделялось большое внимание профилактике и своевременной диагностике инвазивных микозов, поскольку для онкогематологических пациентов в иммуносупрессии присоединение грибковой инфекции может иметь трагические последствия.
Ведущий научный сотрудник РНПЦ ДОГИ, кандидат мед. наук, доцент Михаил Черновецкий занимается данной проблемой давно и многое знает о лабораторной диагностике инвазивных микозов, которая проводится сейчас на базе группы бактериологии отделения инфекционного контроля центра.
«Грибы — отдельное царство живых организмов»
Грибы являются уникальной формой живых организмов — особенности строения, метаболизма и размножения не позволяют отнести их ни к растениям, ни к животным. По морфологическим признакам грибы подразделяются на макромицеты (с плодовыми телами, видными невооруженным глазом) и микромицеты (их можно рассмотреть только под микроскопом), хотя это деление условно.
Михаил Черновецкий:
По организации своей структуры микромицеты устроены сложнее бактерий и вирусов, могут быть одно- или многоклеточными. Они широко распространены в природе — в воде, почве, на растительных остатках и живых растениях, у животных. Общее количество микромицетов оценивается в 1,5 млн видов, при этом идентифицировано около 100 тысяч и ежегодно описывается более 1,5 тысячи видов.
Большинство микромицетов не представляют опасности для человека, а в некоторых случаях, как пекарские и пивные дрожжи, приносят пользу. Однако есть высокопатогенные микромицеты, которые несут угрозу даже для здорового человека с крепкой иммунной системой. В основном это эндемичные виды, характерные для Южной и части Северной Америки, некоторых стран Азии.
Из известных микромицетов порядка 500 видов имеют реальное клиническое значение для человека, из них более 100 видов являются условно-патогенными — способными вызывать клинически выраженное тяжелое заболевание вплоть до грибкового сепсиса у иммуносупрессивных лиц.
Микозы поверхностные и глубокие
Поверхностными микозами, при которых поражаются кожа и ее придатки (волосы, ногти), слизистые оболочки, занимаются в основном дерматологи. Лабораторная диагностика в таких случаях относительно проста: берется соскоб пораженной ткани и смотрится под микроскопом. Инвазивные микозы развиваются, когда споры грибов через дыхательные пути, ЖКТ или открытую рану попадают в организм человека с последующим размножением микромицетов во внутренних органах и тканях. У людей с нормальной иммунной системой этому препятствуют различные защитные механизмы и барьеры. Но у ослабленных пациентов в иммуносупрессии и при некоторых сопутствующих заболеваниях (ВИЧ, СД, онкология) защитные функции снижены, и попавшие, например, в кровь возбудители грибковых заболеваний разносятся по организму, вызывая так называемые системные микозы.
Михаил Черновецкий:
Поскольку подавляющее большинство видов микромицетов относится к условнопатогенной микрофлоре, развитие внутренних грибковых поражений представляет собой сопутствующие (оппортунистические) осложнения на фоне основных заболеваний. Проблема особенно актуальна для пациентов онкогематологических, пульмонологических, фтизиатрических и инфекционных стационаров, а также центров трансплантации органов и тканей. Определенную роль играет внедрение новых, преимущественно инвазивных технологий, а также широкое и не совсем рациональное применение антибактериальной терапии.
«В иммуносупрессии даже свежая дрожжевая булочка может привести к сепсису»
Все пациенты с онкогематологическими заболеваниями на фоне проведения цитостатической и иммуносупрессивной терапии становятся уязвимыми для грибковой микрофлоры.
Михаил Черновецкий:
Особую группу риска составляют дети с острым миелоидным и острым лимфобластным лейкозами, а также реципиенты костного мозга и гемопоэтических стволовых клеток. Поэтому профилактике как грибковых, так и бактериальных осложнений в нашем центре всегда уделяется особое внимание, для этого отделением инфекционного контроля разработан целый комплекс мероприятий.
При госпитализации детей с онкогематологией обязательно обследуют на микрофлору, при подготовке к пересадке ГСК и в процессе химиотерапевтического лечения они находятся в боксированных палатах, в стерильных условиях, им назначается особая диета. Например, категорически запрещена свежая выпечка. Обычная булочка из дрожжевого теста с каким-нибудь микроскопическим участком оставшихся живых клеток дрожжей способна привести к грибковому сепсису. К сожалению, бывали такие единичные случаи, когда Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи) высевались из образцов крови.
Дрожжевые и плесневые микозы
Михаил Черновецкий:
Инфекционные осложнения грибковой этиологии могут быть условно разделены на дрожжевые (дрожжеподобные) и плесневые (мицелиальные) микозы. При этом основным этиологическим агентом дрожжевых микозов являются микромицеты рода Candida, а наиболее частым патогеном плесневых инвазий — грибы рода Aspergillus.
И те, и другие микрокромицеты широко распространены в окружающей среде. Грибы рода Candida могут присутствовать в ротовой полости, ЖКТ, не вызывая никаких симптомов. Они также являются причиной поражения ногтей и межпальцевых промежутков, молочницы у женщин и др. Род Aspergillus включает около 200 разновидностей, порядка 20 из них опасны для человека. Например, Aspergillus niger — возбудитель так называемой черной плесени, которая встречается на испортившихся продуктах питания, опавшей листве деревьев, поражает стены жилища.
Михаил Черновецкий:
Абсолютное большинство септических осложнений, связанных с грибковой микрофлорой, проявляется в виде инвазивных кандидозов и инвазивных аспергиллезов. Но в последнее время имеется негативная тенденция к росту этиологической значимости и других представителей мицелиальной микрофлоры (Mucor, Rhizopus, Fusarium), вызывающих тяжелые поражения организма с резистентностью к противогрибковым лекарственным средствам и уровнем летальности в тяжелых случаях до 90 %.
К слову, напугавший весь мир во время пандемии черный индийский грибок относится к мукоровым грибам, он поражает лор-органы (фронтальную и гайморовые пазухи), прорастает в орбиту глаза, головной мозг. У иммуносупрессивных пациентов к таким же последствиям может привести и аспергилла, она способна прорастать даже сквозь костную ткань! В практике нашего центра около 20 лет назад был случай, когда пациентке пришлось удалять полностью одно легкое и часть лобной доли головного мозга, пораженные Aspergillus.
Этапы и методы лабораторного исследования
Диагностика инвазивных микозов представляет собой сложный комплексный процесс, включающий, как правило, сочетание клинической, рентгенологической и лабораторной диагностики.
Михаил Черновецкий:
Именно на этапе лабораторных исследований проводится индикация и идентификация возбудителей грибкового поражения. Для этого применяются как традиционные микробиологические исследования, так и дополнительные биомаркерные, масс-спектрометрические и молекулярно-генетические методы.
Когда у ребенка на фоне лечения основного онкогематологического заболевания развивается инфекция с повышением температуры, то невозможно сразу понять, что стало причиной — бактерия, вирус или грибок. Поэтому при гипертермии лабораторная диагностика начинается с забора крови и ее посева с целью выделения гемокультур.
Михаил Черновецкий:
Мы получаем биоматериал в специальных гемфлаконах с питательными средами для выделения аэробной, факультативно-анаэробной и грибковой микрофлоры. Чтобы повысить вероятность высева микромицетов, проводится трехкратный в течение суток забор крови. В гемфлаконах также доставляется жидкий материал из спинного мозга, брюшной полости, крупных суставов.
На первом этапе проводится термоинкубация в автоматических культиваторах (до 5 суток). В случае роста во флаконе микрофлоры подается соответствующий световой и звуковой сигнал. Второй этап — микроскопия мазка проросшего биоматериала с одновременным посевом на чашки Петри с дифференциально-диагностическими средами с целью получения так называемой чистой культуры микроорганизма.
При выделении микромицетов из других видов биоматериала (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, биоптаты органов и тканей) наряду с окраской и микроскопией мазка нативного материала производится его непосредственный посев в чашки Петри с питательными средами, с последующим термостатированием в инкубаторе и ежесуточным визуальным контролем роста микрофлоры.
Михаил Черновецкий:
В среднем дрожжевые грибы вырастают через 24–48 часов, плесневые на 5–12-е сутки. Но мы применяем специальную методику с использованием хромогенных агаров, меняющих цвет. Так, при росте на таком агаре колонии Candidа albicans приобретают зеленую окраску, Candida krusei — розовую, и уже через сутки можем провести не только родовую, но и видовую идентификацию возбудителя грибкового заболевания. К сожалению, такой методики нет для плесневых грибов.
Большинство лабораторий в случае высева плесневых грибов завершают диагностику. Лаборатория РНПЦ ДОГИ является единственной в нашей стране, где стараются довести исследование плесневой микрофлоры до родовой и видовой идентификации.
Михаил Черновецкий:
Помимо классического микробиологического фенотипического подхода к идентификации микромицетов в клиническом материале применяем метод масс-спектрометрии. В центре есть уникальный аппарат, работающий на основе метода MALDI-ТOF-МS (матрично-активированной лазерной деструкции/ионизации с времяпролетной масс-спектрометрией).
В основе методики принцип оценки спектра белковой структуры, которая является уникальной для каждого микроорганизма. В базу внесены спектры около 2 тысяч микроорганизмов, не только грибов, но и бактерий. После роста культуры на питательной среде делаем взвесь, вносим на панель, вставляем в прибор и получаем результат через 2 минуты. Это, конечно, высший пилотаж.
Максимально стараемся задействовать этот аппарат для идентификации возбудителей оппортунистических инфекций, ведь это дает возможность клиницистам в кратчайшие сроки назначить лечение с учетом вида выделенных возбудителей и наличия информации об имеющейся у них природной резистентности к отдельным противогрибковым лекарственным средствам.
Определение чувствительности к антимикотикам
Завершающим этапом диагностических исследований является поиск самого эффективного лекарственного средства для выделенного возбудителя.
Михаил Черновецкий:
Для определения ингибирующего воздействия противогрибковых препаратов используем диагностические тест-стрипы с различными концентрациями антимикотиков. Это позволяет определить эффективность применения и минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) лексредств. В отношении возбудителей инвазивных кандидозов используем также диагностические панели для автоматического выявления противогрибковой активности на основе определения МИК.
Правило трех суток и новые разработки
Михаил Черновецкий:
При лечении инвазивных микозов действует такое правило: назначение антимикотиков спустя 3 суток с момента начала инфекционного процесса увеличивает летальность при инвазивных микозах в 3 раза по сравнению с ранним (до 24 часов) началом терапевтических мероприятий. То есть за 3 дня без лечения риск летального исхода возрастает в несколько раз! Поэтому мы продолжаем научные исследования, направленные на сокращение времени идентификации возбудителей микозов.
В частности, у нас есть идеи по определению возбудителя непосредственно в биоматериале без предварительного выделения культуры микромицетов на питательных средах. Не буду заранее раскрывать всех секретов, но если все задуманное получится, то сможем сократить время идентификации возбудителя до 4 часов.