Несмотря на улучшение технологий иммунохимического тестирования, проблемы, связанные со стандартизацией определения уровней гормонов и нежелательной интерференцией, остаются актуальными, отмечает заведующая клинико-диагностической лабораторией РНПЦ радиационной медицины и экологии человека, кандидат мед. наук, доцент Юлия Ярец.
Юлия ЯрецВ рамках республиканской научно-практической конференции «Актуальные вопросы эндокринологии и эндокринной хирургии» на базе РНПЦ РМиЭЧ эксперт обратила внимание на методические особенности лабораторного определения некоторых гормонов в эндокринологической практике. И кроме того, поделилась взглядом на стратегию, позволяющую избежать некорректных лечебных подходов из-за непредвиденных ограничений иммунохимических методов исследования.
Актуальность
Эндокринологи нередко сталкиваются с проблемой интерпретации результатов гормональных исследований и предоставления лабораториями разных референтных значений.
Юлия Ярец:
Это связано с существованием метод-специфических различий, что отражает все еще недостаточный уровень стандартизации применяемых в настоящее время для определения гормонов методов иммуноанализа. Методы, основанные на иммунологическом принципе распознавания веществ, могут отличаться по участкам распознавания молекул гормона, источникам получения применяемых антител, референтному материалу, используемому для калибровки, иметь разную аналитическую специфичность и чувствительность.
Кроме того, помимо референтных пределов (соотносятся с понятием нормы и рассчитываются как диапазон, в который укладывается 95 % значений обследованных достаточной по объему референтной группы практически здоровых лиц соответствующей популяции) для ряда показателей существует понятие диагностического порога, рекомендуемого для диагностики того или иного заболевания.
Порог принятия решений может не совпадать с границей референтных значений. Диагностические пороги разрабатываются в ходе клинических исследований как оптимальная точка условного разделения лиц с повышенной вероятностью наличия исследуемой патологии относительно тех, у кого она, скорее всего, отсутствует.
Юлия Ярец:
Стоит отметить, в ряде случаев производители тест-систем в своих инструкциях указывают лишь «ожидаемые значения» показателя для здоровых (но не референтные значения, валидированные соответственно регламенту валидации референтных значений) и не всегда приводят точные характеристики отобранной референтной группы и условия взятия проб. Часто неизвестно, исключали ли, например, людей с избыточной массой тела, соблюдалось ли условие взятие пробы в утренние часы и прочие характеристики, важные при исследовании многих гормонов.
Информация производителя по ожидаемым значениям показателя сопровождается рекомендацией для лаборатории разработать референтные значения показателя в собственных условиях, что не всегда возможно.
Вопросы стандартизации
Юлия Ярец на нескольких примерах показывает методические особенности определения некоторых гормонов, в частности соматотропного гормона (СТГ), который является важным объектом в практике врача-эндокринолога. Циркулирующий в крови СТГ представлен большим числом молекулярных изоформ, наиболее распространенной из которых является молекула 22кДа (как правило, используется для измерения согласно инструкциям производителей), реже — меньшая молекула 20кДа.
Существуют мультимеры, гомо- и гетеродимеры СТГ. СТГ разделяет эту особенность «молекулярной гетерогенности» с некоторыми другими гормонами, например, хорионическим гонадотропином, также имеющим проблему несопоставимости результатов определения.
Большинство тест-систем распознает определенный спектр изоформ, и почти все связывают 22кДа СТГ, т. к. он является частью антигена, который производитель использует для создания антител для тест-системы. Вероятнее всего, этот спектр для поликлональной антисыворотки шире, чем для моноклональной, что может объяснять разницу между измерениями СТГ при помощи двух разных методов.
Кроме того, в кровотоке 50 % СТГ образует комплекс с СТГ-связывающим белком, поэтому он может быть недоступен для определения антител, что может привести к недооценке концентрации СТГ в образцах, содержащих СТГ в высоких концентрациях. Эта проблема, по словам эксперта, была менее выражена в прошлом, когда использовались анализы с поликлональными антисыворотками и длительным временем инкубации, но, видимо, актуальна для более новых анализов с применением моноклональных антител с определенным эпитопом в сочетании с очень коротким временем инкубации. В связи с этим, например, не рекомендуется определение СТГ в плазме с ЭДТА, т. к. такие результаты выше, чем для образцов сыворотки. Это предполагает влияние и других факторов на концентрацию СТГ.
Юлия Ярец:
Важным фактором, влияющим на результат анализа, является стандарт, используемый для калибровки. Относительно значений калибровочной кривой определяется значение СТГ в исследуемой пробе, т. е. качество анализа зависит от качества стандарта.
Ранее для определения СТГ в качестве калибратора широко применяли СТГ, выделенный из ткани гипофиза (International Standard (IS) 66/217 от 1969 г., IS 80/505 от 1982 г.). Истинное содержание СТГ в этих двух препаратах было неизвестно, и им условно были присвоены концентрации 2,0 и 2,6 Ед/мг соответственно. Впоследствии стали доступны эталонные, «чистые» препараты рекомбинантного происхождения, состоящие исключительно из изоформы 22кДа (IS 88/624 и 98/574). Хотя рекомбинантное происхождение и высокая чистота позволили бы выразить содержание СТГ в единицах массы, препарату IS 88/624 и 98/574 была присвоена биопотенция 3,0 Ед/мг, чтобы можно было провести сравнение с предыдущими экстрактами гипофиза.
Юлия Ярец:
Перевод в другие единицы измерения также создает дополнительные сложности в сопоставлении результатов СТГ. Одни лаборатории представляют данные в Ед/л, другие — в мкг/л или нг/л, и во многих случаях критерии перевода одних единиц в другие не ясны.
Многообразие используемых методов калибровки, а также единиц измерения приводит к сложностям при публикации данных клинических исследований. Ряд клинических рекомендаций подчеркивает необходимость использования «метод-специфических отрезных точек», но для большинства применяемых тест-систем справочной информации по этому вопросу крайне мало, в связи с чем на сегодняшний день это также остается невозможным.
Международная группа специалистов по изучению СТГ (Growth Hormone Research Society) предложила возможные пути стандартизации методов определения СТГ. Применение только рекомбинантного СТГ в качестве калибратора (IS 98/574) и представление данных в едином формате, в единицах массовой концентрации, а именно в мкг/л (или нг/мл), — первые важные шаги в решении данного вопроса.
Growth Hormone Research Society также опубликовала в своих алгоритмах диагностики дефицита СТГ рекомендацию по применению в качестве калибратора только рекомбинантного СТГ (IS 98/574). На это стоит обращать внимание при закупке тест-систем. При использовании в калибровке стандарта IS 98/574 вариабельность в уровне гормона роста между разными лабораториями снизилась с 35 % до 20 %. Точные значения СТГ, калиброванные по международному стандарту 98/574, соответствуют: 1 мЕд = 0,33 мкг. Для выражения результатов в нг/мл необходимо значение СТГ в мЕд/л умножить на 0,33.
Согласно рекомендациям, недостаточность СТГ у взрослых диагностируют при пике выброса СТГ в пробе с инсулиновой гипогликемией менее 3–5 мкг/л, с глюкагоном — менее 3 мкг/л. По словам эксперта, критерии диагностики недостаточности СТГ разработаны только для детей. Тотальный дефицит диагностируется при максимальном выбросе СТГ на фоне стимуляции менее 7 мкг/л (нг/мл), частичный — при пике выброса СТГ от 7 до 10 мкг/л (нг/мл).
Указанные пороговые значения были установлены с помощью поликлональных тест-систем. Нужно ли изменять пороговые значения с появлением новых, более чувствительных тест-систем, по словам эксперта, до сих пор до конца не установлено.
Нюансы исследования ПТГ
Паратгормон (ПТГ) сначала образуется в околощитовидных железах в виде молекулы препроПТГ из 115 аминокислот. После отщепления 25 аминокислот от аминотерминального конца молекулы формируется проПТГ. Следующие 6 аминокислот отщепляются от аминотерминального конца проПТГ, формируя конечный продукт — интактный ПТГ (и-ПТГ), состоящий из 84 аминокислот (1–84 ПТГ).
Лишь около 1 % интактного 1–84 ПТГ достигает клеток-мишеней целевых органов, около 60–70 % метаболизируется в печени, расщепляясь между 33-й и 36-й аминокислотой и образуя С- и N-концевые фрагменты. С-концевые фрагменты молекулы, состоящие из аминокислот 35–84-й последовательности, биологически неактивны и повторно попадают в кровь.
N-концевые фрагменты, состоящие из первых 34 аминокислот, биологически активны. Они составляют значительно меньшую часть циркулирующего ПТГ. С-концевые фрагменты имеют более продолжительный период полужизни и выводятся непосредственно почками. Поэтому у пациентов с хронической болезнью почек количество С-фрагментов (по которым и определяется уровень ПТГ в крови) многократно возрастает. Кроме того, в крови присутствуют различные промежуточные участки метаболизированной молекулы ПТГ, которые могут повлиять на ее уровень.
В настоящее время существуют наборы второго и третьего поколения для определения уровня интактного ПТГ. Наборы второго поколения включают иммунорадиометрические (IRMA) и иммунохемилюминесцентные (ICMA) методы, в которых используются два разных моноклональных антитела: одно против С-концевого участка, другое против N-концевого участка (аминокислоты 1–34). Данная комбинация считалась наиболее специфичной для интактного ПТГ (1–84). Эти методы, по словам эксперта, широко используются, клинические рекомендации и пороговые значения были разработаны применительно к ним.
Юлия Ярец:
Предполагалось, что при определении интактного ПТГ антитело для N-концевого фрагмента связывает все первые 34 аминокислоты, однако в действительности — только усеченные области ПТГ, и некоторые из них, в частности гормонально неактивные С-фрагменты (ПТГ 4–84, ПТГ 7–84, ПТГ 10–84 и ПТГ 15–84), которые не проявляют биологической активности, однако завышают концентрацию биологически активного гормона в сыворотке.
Эти усеченные фрагменты составляют до 20 % иммунореактивного ПТГ в сыворотке у лиц с сохранной функцией почек и до 50 % у лиц с почечной недостаточностью. Количество усеченных фрагментов напрямую зависит от скорости клубочковой фильтрации.
Недавно стали доступны тест-системы третьего поколения, специфичные для интактного ПТГ 1–84, поскольку улавливающее антитело распознает фрагмент ПТГ 39–84, а проявляющее антитело — небольшой N-терминальный участок ПТГ 1–4. Следовательно, они обладают большей диагностической чувствительностью.
Эти тест-системы называются анализами «всего ПТГ (w-PTH)» и обеспечивают улучшенную специфичность для биоактивных полноразмерных ПТГ. В сравнении с наборами второго поколения концентрация и-ПТГ, измеренная с помощью наборов третьего поколения, на 20 % и 50 % ниже у здоровых лиц и у лиц с почечной недостаточностью соответственно. Недостатком данных наборов является то, что они также распознают молекулу ПТГ 1–84, претерпевшую посттрансляционные изменения (фосфорилирование по серину) на участке 15–20 (N-ПТГ) и вследствие этого являющуюся гормонально неактивной формой.
Однако вклад этой молекулы в конечный уровень ПТГ, измеренного с помощью наборов третьего поколения, составляет менее 10 % у здоровых лиц и до 15 % у лиц с почечной недостаточностью.
Юлия Ярец:
Таким образом, истинная активность ПТГ может не отслеживаться с помощью анализов и-ПТГ (второе поколение), т. к. измеряются фрагменты молекулы, отличные от полноразмерного 1–84 ПТГ. Измерение 1–84 ПТГ с помощью третьего поколения реагентов будет иметь большую информативность.
Однако по причине его недостаточной распространенности клинические данные ограничены в сравнении с таковыми для и-ПТГ второго поколения. Значения и-ПТГ (второе поколение) обычно выше, чем 1–84 ПТГ (третье поколение), у пациентов с хронической болезнью почек.
Биотин и проблема интерференции
Значительное количество используемых иммунохимических тест-систем основаны на взаимодействии стрептавидина и биотина, что связано с высокой аффинностью, стабильным взаимодействием двух веществ, а также доступностью различных химических и ферментативных методов биотинилирования без изменения свойств молекулы.
Твердая фаза, покрытая стрептавидином, с которым соединяется биотинилированное антитело или биотинилированный антиген, также может эффективно использоваться в различных иммунохимических тест-системах. Однако, по словам эксперта, за последние годы потребление биотина значительно возросло, и сегодня он не только назначается в качестве лечения, но и применяется в качестве витаминной добавки.
Прием биотина может привести к получению ложноположительных и ложноотрицательных результатов на иммунохимических тест-системах, в основе которых лежит взаимодействие стрептавидин-биотин.
Юлия Ярец:
Например, можно ожидать повышения концентрации Т3, Т4 и антител к рецепторам ТТГ одновременно с низким уровнем ТТГ. Возможна высокая кортизолемия вместе со сниженной концентрацией АКТГ или повышенная концентрация витамина D, сопровождающаяся сниженным уровнем ПТГ. Даже если в большинстве случаев клиническая картина не соответствует гормональному профилю, ошибочные результаты тестов могут привести к задержке назначения терапии из-за сбивающей с толку лабораторной картины или к ненужным исследованиям, из-за чего пациент напрасно тревожится.
Расхождения между клинической и лабораторной картиной вызвало необходимость переоценки результатов гормональных исследований и привело к выявлению аналитического артефакта, обусловленного употреблением биотина (витамин В8 или В7 либо витамин Н) или присутствием антител к стрептавидину.
Некоторые производители реагентов предоставляют информацию о концентрации биотина, при превышении которой может быть получен ошибочный результат. Однако они не указывают, какие суточные дозы биотина соответствуют этим концентрациям, и эти данные не позволяют предвидеть (и предотвратить) получение некорректного результата. При этом концентрация биотина, влияющая на результат, для разных аналитов сильно различается. На самом деле если эти данные получены in vitro при добавлении биотина в разных концентрациях, то могут не отражать ситуацию in vivo.
Когда можно заподозрить интерференцию?
- При несоответствии результатов клинической картине, например, тиреотоксическом лабораторном профиле у пациента с клиническим эутиреозом. Аномалии могут распространяться на другие эндокринные исследования, что усилит подозрение об интерференции.
- При дисбалансе между концентрацией гормона и его регулирующего фактора (вызывает мысли об очень редком синдроме неадекватной секреции ТТГ).
- При крайне необычной концентрации аналита.
- При значительной разнице в результатах, полученных при использовании различных аналитических методов.
Перспективы
Юлия Ярец:
В настоящее время рассматриваются перспективы использования методов неиммунохимического анализа для улучшения определения гормонов. К сожалению, мощные и надежные измерения, такие как метод жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС), еще не адаптированы к высокой производительности, сопоставимой с иммунохимическими тест-системами.
ЖХ/МС/МС представляют собой сложную методику, которая требует достаточно высокого уровня технической подготовки персонала лаборатории. В мире ЖХ/МС/МС начинают получать распространение для анализа ряда небольших молекул, таких как стероиды и метаболиты витамина D. Однако маловероятно, что в обозримом будущем они заменят аналитические методы оценки крупных молекул. Поэтому иммунохимические методы, несмотря на их недостатки, по-прежнему будут широко использоваться, по крайней мере в ближайшие годы.
В заключение эксперт отмечает, что лучшей стратегией, позволяющей избежать некорректных лечебных подходов из-за непредвиденных ограничений иммунохимических методов исследования, остаются критический подход к результатам гормональных исследований, открытая и постоянная связь между персоналом лаборатории и клиницистами.