Особенности формирования иммунитета после перенесенной коронавирусной инфекции, а также серологическая диагностика на всех этапах течения болезни продолжают оставаться предметами изучения специалистов всего мира. Данная тематика обсуждалась на одной из онлайн-сессий в рамках республиканского научно-практического вебинара «Актуальные вопросы биобезопасности и лабораторной диагностики COVID-19», организованного РНПЦ эпидемиологии и микробиологии совместно со страновым офисом ВОЗ при поддержке Минздрава.
Маркеры и методы
Основные маркеры лабораторной диагностики инфекции, вызванной SARS-CoV-2:
- присутствие РНК вируса в респираторных пробах;
- присутствие вируснейтрализующих антител в сыворотке крови.
Методы лабораторной диагностики COVID-19:
- молекулярно-биологический — выявление вирусной РНК методом ПЦР;
- серологический — выявление антител классов IgA, IgG, IgM.
Для грамотной интерпретации результатов данных методов важно понимать особенности развития гуморального ответа иммунной системы в ответ на внедрение SARS-CoV-2. По мере нарастания иммунного ответа и титра противовирусных иммуноглобулинов вирусная нагрузка снижается. После 14-го дня от начала заболевания РНК вируса может не выявляться методом ПЦР. Образование антител в сыворотке крови также имеет свою динамику во времени. Подробнее эта тема была представлена в докладе заведующей лабораторией инфекций с природным резервуаром РНПЦ эпидемиологии и микробиологии, доктора мед. наук, профессора Тамары Амвросьевой.
От чего зависит иммунный ответ
Тамара Амвросьева:
SARS-CoV-2 проникает в клетку благодаря взаимодействию S-белка с клеточным рецептором АСЕ2. После репликации вируса и выхода вирусного потомства часть вирионов захватывается и процессируется антигенпрезентирующими клетками (макрофагами, дендритными клетками). Т-хелперы активируют В-лимфоциты, которые в свою очередь пролиферируют и дифференцируются в В-лимфоциты плазмы. Происходит образование антител (IgM, IgG, IgA) к вирусным белкам S и N, часть из которых нейтрализует вирус и прекращает его дальнейшее распространение.
Результаты многочисленных исследований показывают, что сероконверсия начинается на 5–14-й день от начала клинических проявлений и у большинства пациентов достигает пика на 3–4-й неделе.
Тамара Амвросьева:
Кинетика сероконверсии характеризуется практически одновременным (или с разрывом в 1–3 дня) появлением IgM и IgG. Среднее время начала выявления IgM — 5–17 дней, IgG — 6–14 дней, IgА — 5–22 дня. Коэффициент сероконверсии (доля лиц с антителами) варьирует в зависимости от стадии заболевания. Так, через неделю после начала клинических проявлений IgG обнаруживаются у 4–57 %, IgM у 11–71 % пациентов. В срок 8–14 дней эти показатели составляют 91–100 % для IgG и 56–97 % для IgM.
Специалист отметила, что сроки и последовательность появления разных классов антител часто носят индивидуальный характер и зависят от общего иммунного статуса организма, дозы заражения, тяжести течения инфекции, применяемого лечения и т. д. Так, IgG могут выявляться раньше IgM, у некоторых пациентов IgM могут не обнаруживаться на всем протяжении заболевания, у других ответ IgG может быть поздним или титр очень низким. Бывают случаи, когда IgА определяются в сыворотке крови раньше и дольше, чем IgM, а уровень их выше.
Титр вируснейтрализующих антител коррелирует с возрастом и тяжестью течения COVID-19. При тяжелом течении болезни титр вируснейтрализующих антител, как правило, выше, чем при легком. Есть данные о том, что более напряженный иммунитет вырабатывается в более старших возрастных группах.
Появляется все больше информации о зависимости тяжести течения инфекции от состояния иммунной системы пациента. В условиях быстрой реакции иммунной системы за счет образования вируснейтрализующих антител и подключения клеточного иммунитета инфекция может протекать бессимптомно или относительно легко. В случае же иммунного сбоя и так называемой иммунной дисрегуляции развивается совершенно другой сценарий, возникает цитокиновый шторм с повреждением собственных клеток организма, что может привести к полиорганной системной дисфункции. В этой ситуации инфекция протекает в тяжелой форме с высоким риском летального исхода.
Формируется ли иммунитет при бессимптомном течении инфекции?
Тамара Амвросьева:
В настоящее время однозначно можем сказать, что у всех перенесших инфекцию COVID-19 развивается противовирусный иммунитет к SARS-CoV-2, за исключением лиц с изначально иммунодефицитной патологией.
Во всех странах проводятся исследования по изучению серопревалентности (процента иммунной прослойки среди населения). Для сбора и изучения данных создан интернет-ресурс SeroTracker. В разных странах данные различны, они постоянно меняются, и их не следует сравнивать между собой, т. к. число обследованных и применяемые диагностические наборы различны. Так, в разных регионах Великобритании показатель серопревалентности составляет 0,6–0,8 %, в Швеции — 4,1–8,3 %, США — 0,7–9,3 %, Испании — 4,6 %, Китае — 0,8– 2,46 %.
В России исследование проведено в 27 субъектах с охватом более 70 тысяч человек. Иммунитет к коронавирусу имеют 24–26 % обследованных. В Москве, например, этот показатель колеблется от 11,2 до 13,6 % (в зависимости от округа). Иммунитет формируется и у тех, кто не имел клинических проявлений, в первую очередь у детей. Постинфекционный иммунитет имели 40 % детей и 30 % взрослых, участвующих в исследовании, которые не были ранее зарегистрированы как переболевшие COVID-19.
Исследование серопревалентности к SARS-CoV-2 проводится и в Беларуси. Начиная с апреля прошлого года и по настоящее время они активно ведутся на базе РНПЦ эпидемиологии и микробиологии.
Тамара Амвросьева:
Исследуемый материал получен от 2 751 пациента, в т. ч. от 476 пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19, и 2 175 лиц, которые не были зарегистрированы как переболевшие. Проанализированы 3 694 образца сыворотки крови. Исследования осуществлялись методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Результаты исследования представлены на слайдах 2–4.
Длительность сохранения гуморального иммунитета
Тамара Амвросьева:
Это одна из самых актуальных тем мировой медицины, особенно в условиях второй волны пандемии. Занимаемся данной темой и мы на базе своего учреждения. Самые отдаленные результаты удалось проследить на примере четырех пациентов. Они оценивались на основании коэффициента серопозитивности.
Так, у пациента, который перенес инфекцию в легкой форме, спустя 75 дней после начала клинических проявлений IgG перестали определяться. У остальных, перенесших инфекцию в средне-тяжелой форме, антитела сохранялись и после 150 дней, а у тяжело переболевшего пациента продолжают сохраняться и после 250 дней, т. е. спустя 8 месяцев (исследования продолжаются). Интересные данные получены по одному из пациентов: несмотря на постепенное снижение коэффициента серопозитивности, через 7 месяцев у него появились IgM, что может указывать на факт повторного заражения коронавирусом. При этом данный пациент не заметил никаких признаков инфекции.
Таким образом, результаты серологического тестирования дают основание полагать, что чем более тяжело протекает инфекция, тем дольше сохраняется постинфекционный иммунитет, а при его сохранении человек может избежать повторного развития инфекции.
Область применения серологического тестирования:
- определение иммунного ответа пациента;
- установление факта текущей или перенесенной инфекции (для бессимптомных случаев инфекции, в случае отрицательного результата ПЦР при исследовании мазка из верхних дыхательных путей при позднем обращении пациента либо в случае отсутствия ПЦР-исследования при легком течении инфекции);
- отбор потенциальных доноров иммунокомпетентной плазмы;
- сероэпидемиологические исследования (изучение популяционного иммунитета);
- оценка эффективности вакцинации.
Особенности серодиагностики
Тамара Амвросьева:
Интерпретация результатов серологических тестов при CОVID-19 имеет свои особенности, отличные от таковых при классических вирусных инфекциях. Доминирующим мнением специалистов является признание того, что серологическое тестирование может быть применимо только в качестве дополнения и/или уточнения в комплексе с другими диагностическими исследованиями.
ВАЖНО!
- Результаты тестирования на антитела не являются достаточным основанием для подтверждения или опровержения наличия у пациента активной формы COVID-19. Отрицательный результат серологического теста не исключает факта произошедшего заражения, а положительный не свидетельствует о наличии активного инфекционного процесса и «заразности» пациента. Отрицательные результаты серологического теста имеют двоякую интерпретацию: человек не был инфицирован либо реакция иммунной системы была не настолько сильной, чтобы выработать достаточное количество антител, или не было нужного для выработки антител времени, или их количество оказалось ниже уровня, детектируемого конкретным диагностикумом.
- Результаты серологического тестирования на антитела к SARS-CoV-2 не могут быть единственным основанием (критерием) для установления диагноза COVID-19, они имеют определенную диагностическую значимость при отрицательном результате ПЦР на фоне выраженных клинических проявлений инфекции и положительных результатах методов лучевой визуализации (КТ).
- Результаты серологического тестирования (отрицательные или положительные) без подкрепления их данными ПЦР не являются достаточным основанием для принятия решения о снятии режима самоизоляции и/или возвращения пациента на работу.
- Данные серодиагностики нельзя отдельно использовать для трактовки инфекционного статуса контактных лиц, так как кинетика сероконверсии в отношении IgG или IgM не коррелирует с прекращением выделения вируса.
Комбинация ПЦР и теста на суммарные антитела
Определение суммарных антител в сыворотке/плазме крови (с 10–14-го дня после появления клинических проявлений) является важным тестом, дополняющим обязательное проведение ПЦР-исследований, что обеспечивает наиболее достоверные результаты при диагностике COVID-19.
Тамара Амвросьева пояснила, что результативность выявления суммарных противовирусных антител (IgM/IgG/IgA) к SARS-CoV-2 существенно превышает таковую при определении отдельных классов противовирусных иммуноглобулинов. При этом наименьшую чувствительность имеет определение в сыворотке крови изолированных IgM, что может приводить к получению ложноположительных или ложноотрицательных результатов (см. слайд 5).
Тамара Амвросьева:
Российские специалисты предлагают следующие алгоритмы серологического тестирования. Скрининговую диагностику целесообразно начинать с определения суммарных антител. При их наличии — определение IgМ. При положительном результате определяют спектр антигенов и IgG. При мониторинговой диагностике целесообразен количественный анализ IgM и IgG.
На белорусском рынке присутствует более 10 наборов реагентов для проведения исследований методом ИФА отечественного и иностранного производства. Прошли государственную регистрацию наборы двух отечественных производителей. Среди них три разработаны на базе РНПЦ эпидемиологии и микробиологии:
- набор реагентов для выявления суммарных антител IgA, IgM, IgG к коронавирусу SARS-CoV-2 методом ИФА «SARS-CoV-2-РекИФА-АТ».
- набор реагентов для выявления IgМ к коронавирусу SARS-CoV-2 методом ИФА «SARS-CoV-2-NP-ИФА-М»;
- набор реагентов для выявления IgG к коронавирусу SARS-CoV-2 методом ИФА «SARS-CoV-2-NP-ИФА-G».