О структурной биологии и молекулярных механизмах вируса, вызвавшего пандемию COVID-19, «МВ» рассказал главный научный сотрудник лаборатории иммунологии и клеточной биофизики Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, доктор биол. наук Валерий Вересов.
Основополагающий белок
Валерий Гаврилович, опишите подробнее структуру SARS-CoV-2
img src="/images/Валерий_Гаврилович.jpg" alt="Валерий Га" width="260" class="image" style="margin: 12px 12px" title=" главный научный " /></i></b></div><div> </div><" />Это оболочечный вирус, который прина"лежит к подсемейству Coronavirinae семейства Coronaviridae. Каждый вирион его имеет диаметр 50–200 нм.
Подобно другим коронавирусам, SARS-CoV-2 содержит 4 структурных белка:
S-белок (белок-шип), E-белок (белок оболочки вируса), M-белок (мембранный белок) и N-белок (белок нуклеокапсида, образующий комплекс с РНК). Вместе они участвуют в образовании оболочки вируса.
В ряде исследований было показано, что рецептором для S-белка вириона на клетках-мишенях является ангиотензин-конвертирующий фермент 2 (angiotensin-converting enzyme 2; ACE2).
Ранее было показано, что этот белок является рецептором также и для S-белка SARS-CoV, однако связывание с SARS-CoV-2 осуществляется по-иному.
Были рассчитаны значения свободных энергий для связывания ACE2 с S-белком SARS-CoV-2 и SARS-CoV, которые привели в первом случае к значению -50,6 ккал/моль, а во втором — -78,6 ккал/моль. Такое различие в сродстве при связывании с ACE2 позволяет объяснить более высокие вирулентность и летальность и более низкую контагиозность SARS-CoV по сравнению с SARS-CoV-2: инфицирование происходит интенсивнее, что приводит к более быстрому прогрессированию заболевания. В то же время бессимптомный период при SARS-CoV короче.
Доставка РНК-содержимого вируса в инфицируемую клетку также опосредуется трансмембранным гликобелком-шипом (S), который экспонирован на поверхности вируса. Белок S включает две функциональные единицы S1 и S2. Первая ответственна за связывание вируса с рецептором, вторая — за эндоцитоз (слияние мембран вируса и клетки-хозяина).
Как новый вирус влияет на процесс гибели клеток?
SARS-CoV-2 наравне с SARS-CoV осуществляет свое патологическое действие цитоцидно (убивая клетки-мишени) и через иммуноопосредованные механизмы. Так как ACE2 сильно экспрессирован на апикальной стороне эпителиальных клеток легких в области альвеол, вирус может входить в них и разрушать. Исследования с использованием культуры клеток показали, что коронавирусная инфекция приводит к таким цитопатическим эффектам, как лизис клеток и апоптоз.
Также данный вирус иногда обусловливает слияние клеток с образованием синцития. Эти три цитопатических эффекта могут быть связаны с возникновением репликативного комплекса при репликации вируса.
Как SARS-CoV, так и SARS-CoV-2 вызывают фиброз тканей. Вероятным механизмом может быть действие N-белка, который, как было установлено, индуцирует промоторную активность гена протромбиназы, что коррелирует с отложением фибрина.
В чем заключаются механизмы воздействия вируса на организм, опосредованные иммунной системой?
Механизмы как врожденной, так и адаптивной иммунных систем участвуют в патогенезе SARS-CoV и SARS-CoV-2. Эпителиальные и дендритные клетки, альвеолярные макрофаги являются тремя основными компонентами врожденного иммунитета в дыхательных путях. Дендритные клетки находятся под эпителием, а макрофаги на апикальной стороне эпителия. Также имеет место иммунный ответ, опосредованный T-клетками при инфицировании коронавирусами. T-клеточные ответы начинаются с представления антигена дендритными клетками или макрофагами.
Как SARS-CoV-2 входит в антигенпрезентирующие клетки (АПК), недостаточно ясно. Возможным механизмом рассматривается фагоцитоз инфицированных вирусом апоптотических клеток дендритными или макрофагами. Иным может быть вхождение вируса в АПК через ACE2, экспрессированные на мембранах дендритных клеток и макрофагов в незначительных количествах.
Проведенные иммунологические исследования у больных COVID-19 показали истощение пула СD8+T-клеток и в то же время повышенное содержание провоспалительных цитокинов, включая Ил-6, Ил-10, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), белок-хемоаттрактант моноцитов 1 (MCP1), воспалительный белок макрофагов (MIP) 1α, а также фактор некроза опухолей (TNF)-α. У наиболее тяжелых пациентов наблюдался высокий уровень Ил-6.
Интересным фактом, обнаруженным у больных COVID-19, является наличие аберрантных патогенетических CD4+T-клеток, коэкспрессирующих (IFN)-γ и Г-КСФ. Ранее было показано, что наличие таких аберрантных Г-КСФ+IFN-γ+CD4+T клеток ответственно за возникновение некоторых аутоиммунных заболеваний. Это позволяет предположить аутоиммунный сценарий также и в случае COVID-19.
В легких пациентов с коронавирусной инфекцией было обнаружено большое количество провоспалительных клеток как врожденной, так и адаптивной иммунной системы. Среди первых преобладали нейтрофилы и CD14+CD16+моноциты. Известно, что нейтрофилы в случае их повышенной концентрации способны повреждать легкие. CD14+CD16+ моноциты экспрессировали в большом количестве цитокины Ил-6, которые могут быть ответственны за системные нарушения, такие как цитокиновый шторм. Высказано предположение, что он происходит при массивном вхождении макрофагов в дыхательные пути и высвобождении цитокинов.
Стратегии против коронавируса
Известно, что COVID-19 протекает в несколько этапов. Как ведет себя SARS-CoV-2 на каждом из них?
Структурные исследования позволяют предположить, что основным отличием SARS-CoV-2 от SARS-CoV является более эффективное и быстрое вхождение последнего в клетку и, как следствие, его большая вирулентность. Вероятно, SARS-CoV-2 повторяет все стадии инфицирования SARS-CoV, хотя и с несколько иным таймингом.
На 1-й стадии — бессимптомного течения заболевания, 1–2-й день инфицирования — вирус SARS-CoV-2 связывается с рецептором ACE2 на поверхности эпителиальных клеток носовой полости, входит в них путем эндоцитоза и реплицируется. Здесь имеет место ограниченный иммунный ответ. Далее вирус связывается с рецептором ACE2 на поверхности реснитчатых клеток носа и верхних дыхательных путей, экспрессирующих рецептор ACE2.
На 2-й стадии — поражения верхних дыхательных путей (следующие несколько дней) — вирус распространяется вниз по дыхательному пути, отмечается более сильный иммунный ответ. На этой стадии уже появляются первые клинические симптомы. Инфицированные эпителиальные клетки секретируют интерфероны β и λ. Для 80 % зараженных иммунный ответ предотвратит распространение инфекции ниже по дыхательным путям.
К сожалению, у около 20 % пациентов болезнь может перейти в 3-ю стадию — гипоксии, инфильтратов «матового стекла» и перехода в острый респираторный дистресс-синдром. При этом вирус достигает отделов газообмена в легких и инфицирует альвеолярные клетки 2-го типа. В них реплицируется большое количество вирусов. Клетки подвергаются апоптозу и умирают.
Произведенные вирусы поражают соседние клетки, конечным итогом может быть диффузное альвеолярное поражение с полной потерей альвеолярных клеток 2-го типа. При этом запускаются механизмы их регенерации. Восстановление эпителия возможно при мощном врожденном и приобретенном иммунном ответе. Однако данная регенерация эпителия может пойти по крайне опасному пути, если будет задействован фактор роста кератиноцитов (KGF), в результате чего восстанавливаемые клетки могут содержать ACE2 на своей поверхности в большом количестве. Это, в свою очередь, приведет к дополнительной вспышке репликации вируса и существенному увеличению вирусной нагрузки. Эта стадия крайне опасна для пожилых людей из-за слабого иммунного ответа и сниженной регенеративной способности.
С учетом всего сказанного какими могут быть потенциальные антикоронавирусные стратегии?
В зависимости от таргетируемых мишеней их можно отнести к двум категориям. Первая — стратегии, использующие действие на иммунную систему, вторая — стратегии, использующие действие на сам коронавирус, включая связывание с рецептором на клетке-мишени, вхождение в клетку и репликацию. Ответ врожденной иммунной системы играет важную роль, интерферон способен усилить иммунный ответ. С другой стороны, блокирование сигнальных путей, с участием которых происходит репликация вируса, способно также оказать серьезный противовирусный эффект.
Во второй стратегии можно выделить четыре подстратегии: препятствование синтезу вирусных РНК за счет действия на генетический материал, ингибирование ферментов, критических для репликации, блокирование связывания вируса с рецептором и ингибирование процесса самосборки вируса.
Что касается лекарственных средств, целесообразно применять следующие две стратегии. Во-первых, протестировать с точки зрения эффективности существующие противовирусные препараты широкого спектра действия. В эту категорию могут быть включены интерфероны, рибавирин, ингибиторы циклофилина. Преимущество данного подхода заключается в том, что указанные препараты уже проверены на безопасность и их побочные эффекты известны. Недостатки — их неспецифичность и неспособность убить вирус.
Во-вторых, провести высокопропускной и/или виртуальный скрининг существующих лекарственных средств, предварительно построив гомологические модели белков, критических для действия коронавируса: вирусная папаин-подобная протеаза (PLpro), главная протеаза (3CLpro), РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp), хеликаза, шип-белок. Начальные исследования такого типа выполнены китайскими учеными.